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共培养的角膜上皮细胞诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞

时间:2019-12-20 15:47

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  摘要:目的探讨体外培养人羊膜上皮细胞(HAEC)并定向诱导分化为角膜上皮样细胞的可行性。方法采用Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶消化分离培养HAEC,通过TranswellTM非接触共培养系统与人角膜上皮细胞(CEC)进行共培养2周,诱导HAEC分化;通过免疫荧光细胞化学染色法检测诱导后HAEC中细胞角蛋白3+12(CK3+12)、CK14、CK19、增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测分化细胞CK12、CK14、CK19、P63mRNA水平,Westernblot法检测HAEC诱导前后CK3+12、CK14、CK19、P63的蛋白水平。结果体外培养的HAEC和CEC形态相似,免疫荧光细胞化学染色检测到HAEC诱导分化细胞CK3+12、CK14、CK19、PCNA呈阳性表达,诱导后HAEC中P63、CK12、CK19、CK14mRNA相对表达量分别为共培养前的3.35、6.76、2.42、1.06倍。结论在与CEC共培养2周后,HAEC可以转分化为角膜上皮样细胞,HAEC可用作组织工程角膜重建的种子细胞。
  关键词:羊膜上皮细胞;角膜;共培养;转分化;

  角膜位于眼球的表面,暴露在外界环境中,容易受到各种微生物的感染和外伤如热烧伤、化学伤等,严重者常导致角膜盲。对于角膜盲目前唯一有效的治疗是进行角膜移植,但角膜移植存在供体缺乏、移植免疫排斥反应等问题,而组织工程角膜给角膜盲患者带来了新的希望[1-2],是当前的研究热点。研究表明人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,HAEC)具有胚胎干细胞的多能性[3],能够向3个胚层细胞分化,同时HAEC表达人类白细胞抗原G(human leukocyte antigen G,HLA-G),被认为是一种免疫赦免细胞,不会引起免疫排斥反应的发生[4],且来源丰富,无伦理争议,被认为是组织工程的一种理想种子细胞来源[5]。本研究探讨HAEC向角膜上皮诱导分化的方法,对诱导分化后细胞的生物学性状、蛋白表达、基因表达进行鉴定,为其在组织工程角膜中的应用提供依据。

  1材料和方法

  1.1材料
  人羊膜取自暨南大学附属第一医院经伦理学委员会批准且知情同意的剖宫产分娩健康产妇的胎膜;来源于人角膜缘的角膜上皮细胞(corneal epithelial cells,CEC)株由中山大学中山眼科中心王智崇教授惠赠;Ⅱ型胶原蛋白酶、DMEM培养基购自Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Hyclone公司,表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)购自Peprotech公司;胰蛋白酶、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购自Sigma公司,小鼠抗人细胞角蛋白3+12(cyto keratin 3+12,CK3+12)单克隆抗体、Cy3标记的山羊抗兔IgG、Cy3标记的山羊抗小鼠IgG购自Abcam公司,兔抗人CK14多克隆抗体、兔抗人CK19多克隆抗体、兔抗人增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)多克隆抗体、兔抗人CK4多克隆抗体、兔抗人P63多克隆抗体购自Proteintech公司,HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的驴抗小鼠IgG购自R&DSystems公司,RNA提取试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒及cDNA逆转录试剂盒购自ToYoBo公司。
  1.2方法
  1.2.1HAEC的体外培养
  HAEC的培养方法同前期研究[6]。简述如下:无菌取材,将羊膜用含有100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的PBS清洗干净,将羊膜剪成乳糜状,以2g/L的Ⅱ型胶原蛋白酶及2.5g/L胰蛋白酶分步消化,收集细胞,加入含有10ng/mLEGF和100mL/LFBS的DMEM培养基重悬细胞,置于37℃、50mL/LCO2培养箱内培养,隔天换液,待细胞生长增殖到80%汇合时按1∶2~1∶3传代。
  1.2.2人CEC的体外培养
  人CEC以1×105个/mL细胞数接种至培养瓶中,放入37℃、50mL/LCO2的细胞培养箱中培养,隔日换液1次。细胞生长达到80%汇合时要及时传代,用PBS液漂洗2次,加入2.5g/L胰蛋白酶联合0.2g/LEDTA消化液,放入37℃培养箱消化2~3min,加入含100mL/LFBS的培养基中止消化,1000r/min离心5min。吸除上清液,加入DMEM完全培养基,按1∶4传代。
  1.2.3HAEC与人CEC共培养诱导分化
  采用Transwe ll TM培养皿,其微孔膜直径为0.4μm。在Transwe ll TM培养皿中接种人CEC,下层6孔板中接种HAEC,两种细胞通过微孔膜隔离,但培养基可以自由流通。每天倒置显微镜下观察细胞的生长情况,每2d半量换液1次。在37℃、50mL/LCO2的细胞培养箱中静置培养14d。
  1.2.4免疫荧光细胞化学染色法检测HAEC共培养诱导前后及CEC的CK3+12、CK14、CK19、PCNA蛋白表达
  共培养2周后,取出细胞爬片,PBS液清洗,40g/L多聚甲醛固定30min;5mL/LTritonX-100穿孔15min,滴加封闭液,室温30min。滴加小鼠抗CK3+12抗体(1∶50)、兔抗CK14抗体(1∶30)、兔抗CK19抗体(1∶30)、兔抗PCNA抗体(1∶50),4℃过夜;PBS洗涤5min×3次,滴加Cy3标记的山羊抗兔IgG(1∶1000)或Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(1∶200),37℃孵育30min;PBS洗涤5min×3次,滴加DAPI复染液,室温避光孵育5min;PBS洗涤5min×3次,风干,滴加抗荧光衰减封片剂封片,荧光显微镜观察。
  1.2.5荧光定量PCR检测HAEC诱导培养前后的CK12、CK19、CK14、P63mRNA表达
  根据TRIzol试剂盒说明书提取共培养前、后HAEC总RNA。逆转录合成cDNA,内参为β-actin,检测共培养前、后HAEC中CK12、CK19、CK14和P63的mRNA表达水平。CK12上游引物为5'-GCAGAGTGTGATAG-GCAGACC-3',下游引物为5'-TCCAAAGCTACCTC-CACCCA-3',产物大小217bp;CK19上游引物为5'-TATCCGCCCCTGACACCATT-3',下游引物为5'-GTAGGAAGTCATGGCGAGGC-3',产物大小151bp;CK14上游引物为5'-CAGGAGATGATTGGCAGCGT-3',下游引物为5'-CCATGACCTTGGTGCGGATT-3',产物大小241bp;P63上游引物为5'-GGAACAGCCATGC-CCAGTAT-3',下游引物为5'-GTAGGAAGTCATG-GCGAGGC-3',产物大小148bp;β-actin上游引物为5'-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGAT-3',下游引物为5'-CTTGCACATGCCGGAGCCGTT-3',产物大小109bp;反应条件为95℃10min预变性,95℃15s,60℃30s,72℃15s,共重复40个循环,每组实验重复3次。
  1.2.6Westernblot法检测HAEC中CK3+12、CK14、CK19、P63的蛋白水平
  将诱导前的第2代的HAEC、诱导培养14d后的HAEC及培养的人CEC用PBS漂洗2次;加入裂解液,充分裂解后,12000g离心3~5min,取上清。进行SDS-PAGE,湿法转膜,37℃封闭1h;分别加入1∶1000稀释的小鼠抗人CK3+12抗体、兔抗人CK14抗体、兔抗人CK19抗体、兔抗人P63抗体,4℃孵育过夜;PBST洗膜5min×4次,分别加入1∶30000稀释的HRP标记的驴抗小鼠IgG或HRP标记的山羊抗兔IgG,37℃反应1h;PBST洗膜5min×5次;用化学发光法显影、拍照。
  1.2.7统计学分析
  实验数据以±s表示,采用单因素方差分析,用SPSS16统计软件对数据进行统计学运算,P<0.05为差异有统计学意义。

  2结果

  2.1诱导培养细胞的形态学特点
  人CEC呈三角形、多边形,细胞长满后镶嵌排列呈铺路石状,细胞生长速度快,一般2d就要传代;如果传代不及时,细胞会从瓶壁自行脱落。HAEC原代生长较慢,一般要5~7d才能长满,细胞与瓶壁贴附紧密,传代时不易从瓶壁脱落。人CEC和HAEC共培养后,细胞呈贴壁生长,形态以不规则形、多边形为主,细胞折光性下降,胞质中颗粒物增多(图1)。
  图1培养细胞的形态(相差显微镜,×100)
  
  2.2HAEC共培养诱导后表达CK3+12,在诱导前后CK14、CK19、PCNA均表达
  免疫荧光结果显示诱导前HAEC不表达CK3+12,诱导2周后HAEC胞质见红色荧光,即CK3+12表达阳性;DAPI染色显示蓝色荧光为细胞核。CK14、CK19、PCNA在诱导前后均有表达(图2)。
  图2HAEC共培养诱导前后的CK19、CK14、CK3+12、PCNA蛋白表达(免疫荧光细胞化学染色,×100)
  
  2.3HAEC诱导培养后的P63、CK14、CK19表达增加,CK3+12由诱导前的阴性表达转变为阳性表达
  共培养前后HAEC中P63、CK3+12、CK14、CK19基因和内参基因β-actin的mRNA表达均以Ct值表示,各组P63、CK3+12、CK14、CK19基因的mRNA相对表达量为2-ΔΔCt。单因素方差分析结果显示:共培养2周后HAEC中P63、CK3+12、CK19mRNA相对表达量均高于共培养前,其表达量分别为共培养前的3.35、6.76、2.42倍,差异有统计学意义(P<0.05),CK14mRNA的相对表达量是共培养前的1.06倍,差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot法检测HAEC诱导前、后及CEC的CK3+12、CK14、CK19、P63蛋白的表达(图3),CK14、CK19、P63蛋白诱导前、后均呈阳性表达,CK3+12从诱导前阴性表达转变为诱导后阳性表达。
  图3HAEC诱导前后蛋白的表达
  

  3讨论

  角膜的透明性决定着视觉质量的好坏,角膜上皮位于角膜的表层,角膜上皮的完整性和无血管是维护角膜透明性的重要因素[7]。角膜的炎症、化学伤、复发性翼状胬肉、Stevens-Johnson综合征和眼类天疱疮等疾病可导致角膜上皮缺损,角膜上皮结膜化、角膜新生血管等,严重影响视力[8]。目前对于这些疾病的治疗还存在一些不足之处,如同种异体角膜缘移植存在免疫排斥反应,存活率不高的问题;自体角膜缘移植又会导致健康眼角膜缘组织的损伤[9]。近年来组织工程技术的发展为其治疗带来了良好前景。HAEC起源于外胚层,具有类似胚胎干细胞的分化能力,表达多能干细胞标志阶段特异性胚胎抗原4(stage-specific embryonic antigen4,SSEA-4)、TRA-1-60、TRA-1-81、八聚体结合蛋白4(octamer-binding protein4,Oct-4)和Nanog,可向三个胚层分化,呈现多能性,可代替成体干细胞用于再生医学领域[10-11]。相较于成体干细胞,HAEC有更强的增殖和转分化能力[12],且来源丰富,在再生医学领域进行了广泛的研究。目前已证实其可以分化为神经元[13]、肝细胞[14]、胰岛细胞[15]、内皮细胞[16]、结膜上皮细胞[17]、皮肤细胞[18]和毛囊细胞[19]等,Fatimah等[20]发现HAEC有上皮干细胞的特征,推测其具有分化为CEC的潜能。
  体外培养角膜基质细胞[21]、CEC[22]、角膜缘成纤维细胞[23-24],模拟CEC在体内的微环境,以共培养方式成功诱导干细胞转分化为CEC。以往实验多采用动物角膜细胞进行诱导培养,这就面临着异种动物传播未知疾病的风险。因此,我们尝试以CEC培养液体外模拟CEC生长的微环境来诱导HAEC向CEC转分化,所采用的角膜上皮细胞系是通过连续传代的方法建立的,较好的保持了CEC的形态特征,具有较强的增殖能力,易于体外培养且不具有致瘤性。因此,HAEC在体外诱导实验中有一定的优势。
  一般认为CK19和p63表达于具有高度增生能力的角膜上皮干细胞,可能是角膜上皮干细胞的标志[25-26]。在本研究中细胞免疫荧光结果显示诱导分化的HAEC表达P63和CK19,且实时定量PCR和Western blot结果也提示诱导分化的HAEC具有角膜上皮干细胞的类似功能。HAEC同时还表达角蛋白CK14,且PCNA在诱导前后均表达,显示细胞具有较强的增殖能力。CK12表达部位存在于中央角膜全层上皮细胞和角膜缘上层基底细胞。目前公认CK12为CEC的特异性标志物,CK12通常与CK3成对表达[27]。在与CEC共培养的条件下,HAEC诱导分化细胞表达CK3+12,表明HAEC经过诱导培养后具有CEC的功能,显示HAEC作为组织工程角膜种子细胞源的潜在应用前景,也进一步证实HAEC具有成体干细胞的转分化能力。
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