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人原代角质形成细胞在两种培养基中增殖能力的比较

时间:2019-12-20 15:47

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  摘要:目的:比较第一代和第二代人原代角质形成细胞 (human primary keratinocytes, HPK) 在两种培养基[ (EpiLife培养基+HKGS) 和DK-SFM培养基]中增殖能力的差异。方法:通过两步法从人的皮肤组织获得第一代HPK, 进行传代后获得第二代HPK, 采用细胞计数仪计数, 绘制生长曲线。用免疫荧光技术鉴定第二代HPK, 并用流式细胞术检测其细胞周期。结果:从HPK生长曲线可见, 在DK-SFM培养基中, 第一代HPK的增殖速率高于 (EpiLife培养基+HKGS) 中, 第二代HPK的增殖速率低于 (EpiLife培养基+HKGS) 培养中。细胞周期结果同上, 第二代HPK在DK-SFM中其G2期细胞和S期细胞含量分别为8.5%和11.2%, 低于在 (EpiLife培养基+HKGS) 中的13.9%和18.3%。结论:两种培养基培养HPK各有利弊, 若想在短期获得纯度较高的HPK, 选择DK-SFM培养基较好;若想相对长期培养HPK, 选择 (EpiLife培养基+HKGS) 更有优势。
  关键词:角质形成细胞;细胞培养技术;EpiLife培养基;defined-keratinocyte serum-free培养基;

  皮肤是人体最大的器官。皮肤最外层的表皮层, 是人体保护机体免受外界影响的重要物理屏障和免疫屏障[1]。角质形成细胞是表皮的主要构成细胞, 也是皮肤组织工程技术中较难获得和培养的种子细胞。获得纯度高、增殖能力强、传代次数多的角质形成细胞, 是其中的一个关键点。表皮角质形成细胞分为干细胞、过渡期增殖细胞和定向细胞[2]。生理状态下, 表皮干细胞会分化成过渡期增殖细胞, 其经过有限次数的分裂后, 进而向表皮上层迁移分化。定向细胞是指已经失去分裂能力, 并不可逆开始角化过程的细胞[3]。角质形成细胞的培养主要来源是前两种有增殖能力的细胞。本实验用两步消化法提取原代细胞:即先用中性蛋白酶消化皮肤组织, 选择性地破坏将表皮锚定在其下致密板上的半桥粒[4,5], 从而达到准确分离真表皮的作用;再用胶原酶消化表皮, 获得表皮中的原代细胞。该方法获得的角质形成细胞数量多, 纯度相对较高。
提取出的角质形成细胞较难培养, 需要在较高要求的环境中生长。1975年Rheinwald等[6,7]采用小鼠胚胎瘤的成纤维细胞株3T3作为滋养层, 建立了角质形成细胞的培养方法。该方法虽能显著促进角质形成细胞的贴壁和增殖, 但3T3作为异种细胞, 会分泌异种蛋白质以及抗原, 这可能会导致后续构建的人工表皮对受体产生免疫排斥反应。另外, 早期均采用含血清的培养基培养细胞, 由于血清成分复杂, 不明因子较多, 会影响角质形成细胞的细胞因子的释放、特殊抗原和受体的表达, 不利于针对角质形成细胞的生理病理等的精细研究[8]。1980年Richard等人开发出一种成分相对明确的无血清培养基 (MCDB151、MCDB152) 。此配方中添加了牛脑垂体提取物 (BPE) , 不含血清, 也不需要成纤维细胞滋养层, 排除了复杂的血清成分和异种细胞对角质形成细胞产生的不利影响, 此后衍生出多种同类型无血清培养基 (MCDB153、EpiLife和KGM-2等) [9-12]。本实验使用的 (EpiLife培养基+HKGS) 是在培养基MCDB 151和MCDB 152的基础上发展出的改良版培养基, 含有两种培养基中的重要成分BPE, 细胞传代次数可更多。然而, 加入的BPE只是一种较于血清而言成分相对明确。其作为一种重要的丝裂原, 缺点包括成分复杂, 作用机制不明;浓度较难掌控, 与细胞增殖速度无浓度效应关系[13];保存时间短 (一个月内有效) 。本实验使用的DK-SFM培养基, 是Gibco公司开发的不含BPE、成分确定的培养基, BPE的生长促进活性被成纤维生长因子等生长促进剂取代, 其中所含的某些成分可抑制成纤维细胞等杂质细胞的生长, 成分明确使得培养基具有了更为一致的性能。但 (EpiLife培养基+HKGS) 与DK-SFM培养基中角质形成细胞的增殖能力是否一致还未见相关报道。因此, 比较使用这两种培养基培养的角质形成细胞的增殖能力, 对人原代角质形成细胞 (human primary keratinocytes, HPK) 的有效利用具有现实意义。本实验将采用生长曲线、免疫荧光、流式细胞术测细胞周期的方法, 比较在两种培养基中生长的HPK的差异。

1 材料

1.1 标本来源
标本来源于2016年3月至2016年9月在第二军医大学长海医院整形外科行包皮环切术的健康成年男性共15例, 年龄21~30周岁。本研究获得书面知情同意书, 经本院伦理委员会批准。
1.2 试剂和药品
中性蛋白酶 (DispaseⅡ, 瑞士罗氏公司) ;胶原酶Ⅰ (美国西格玛奥德里奇公司) ;磷酸盐缓冲液 (PBS) 、TrypLE Express酶 (TE) 、Defined-Keratinocyte Serum-Free Medium (DK-SFM) 、EpiLife培养基 (EM) 、人角质形成细胞生长添加剂 (human keratinocyte growth supplement, HKGS) 和Coating Matrix Kit (美国Gibco公司) ;硫酸庆大霉素溶液 (北京雷根生物技术有限公司) ;兔抗人角蛋白6单克隆抗体 (CK6, 英国Abcam公司) ;Cy3-山羊抗兔荧光二抗、破膜工作液、DAPI、抗荧光淬灭封片剂 (武汉谷歌生物科技有限公司) ;PI染色试剂盒 (杭州联科生物技术股份有限公司)
1.3 仪器
100μm细胞筛网 (美国BD公司) ;25cm2细胞培养瓶和96孔板 (美国康宁公司) ;CKX31倒置相差显微镜 (日本奥林巴斯公司) ;MACSQuant (R) VYB流式细胞仪 (德国Miltenyi公司) ;Cellometer Mini自动细胞计数仪 (美国Nexcelom公司) ;Nikon Eclipse CI正置荧光显微镜、Nikon DS-U3成像系统 (日本尼康公司) ;GT1001组化笔 (Gene Tech公司) 。

2 方法

2.1 完全培养基的配制
将5ml的HKGS加入500 ml EpiLife培养基内, 轻柔混匀, 标记为 (EpiLife培养基+HKGS) 。将DK-SFM标记为DK-SFM培养基, 在用DK-SFM培养基接种细胞前, 需先用Coating Matrix试剂盒包被培养瓶。
2.2 HPK的分离培养
HPK的分离培养采取两步消化法进行。将整形外科手术后的包皮样本于无菌条件下冷藏带回实验室, 将新鲜皮肤组织放于含20μg/ml庆大霉素的PBS中漂洗3次, 用手术剪刀和手术镊子去除皮下脂肪和筋膜组织。将处理后的皮肤样品剪成2 mm×5 mm大小的小块, 放入含0.2%DispaseⅡ的无菌离心管中, 以完全浸没为度, 4℃过夜。次日用眼科手术镊子分离表皮层和真皮层, 在无菌离心管中加入预温的TrypLE Express酶, 将表皮层剪成1mm×1mm×1mm, 放入离心管, 以完全浸没为度。37℃水浴震荡消化15min后, 过100μm细胞筛网。向滤液中加入10ml PBS终止消化, 350×g离心5min, 获得细胞沉淀。分别用含5μg/ml庆大霉素溶液的 (EpiLife培养基+HKGS) 或DK-SFM培养基重悬细胞, 以1×106个/ml的密度接种至25cm2的培养瓶内。接种3d后, 倒置显微镜下观察细胞生长形态并换液, 此后根据细胞生长状况每隔2~3d换液1次, 并记录原代细胞融合时间。
2.3 HPK的传代
当HPK 80%~90%融合时, 弃去培养液, 用无钙镁离子的PBS漂洗一次, 加入TrypLE Express酶, 37℃消化15~20min, 镜下观察细胞变圆后, 加入PBS, 终止TrypLE Express酶的作用。将细胞轻柔吹落, 吹打成细胞悬液, 350×g离心5min。再将细胞重悬, 以5×105个/ml的密度接种至25cm2的培养瓶内, 当细胞80%~90%融合时再次传代。
2.4 第二代HPK的鉴定与形态学观察
用免疫荧光技术进行鉴定。当HPK 80%~90%融合时, 弃去培养液, 洗涤细胞, 用TrypLE Express酶消化细胞, 调整细胞悬液浓度, 以等细胞浓度, 用 (EpiLife培养基+HKGS) 和DK-SFM培养基分别接种于盖玻片上的爬片进行培养, 使用DK-SFM培养基培养时盖玻片需包被。贴壁后, 每隔2~3d换液。细胞爬片一周后, 将爬片甩干, 用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的地方画圈, 加150μl破膜封闭液。室温孵育30min后, 用PBS洗涤3次。轻轻甩掉封闭液, 在细胞孔板中滴加配好的一抗CK6 (用PBS按1∶100稀释) , 放于湿盒内4℃孵育过夜。次日, 用PBS洗涤爬片3次, 圈内滴加稀释好的荧光二抗Cy3-山羊抗兔荧光二抗 (用PBS按1∶300稀释) , 避光室温孵育50min。再用PBS洗涤, 爬片3次, 圈内滴加DAPI染液, 避光室温孵育10min。最后, 用PBS洗涤爬片, 稍甩干后将有细胞的一面朝下, 用抗荧光淬灭封片剂将玻片封固在载玻片上封片。切片于尼康正置荧光显微镜下观察并采集图像。在紫外光的激发下, DAPI染出来的细胞核为蓝色, 阳性表达角蛋白6的细胞质为红色。
2.5第二代HPK的周期检测
当第一代HPK80%~90%融合时, 进行传代, 待第二代长至70%融合时, 收集足量细胞, 按照PI染色试剂盒说明处理样品, 用流式细胞仪分别检测两种不同培养基中生长的第二代HPK的细胞周期。
2.6 生长曲线的绘制
取第一代和第二代HPK, 以同样的密度 (第一代HPK:2×105个/ml;第二代HPK:8×104个/ml) 接种于6孔板上, 分别用两种培养基培养。注意用DK-SFM培养基接种细胞时, 6孔板应用Coating Matrix Kit包被。细胞贴壁后, 每隔2~3d换液一次。分别于接种后两周内, 每隔24h, 取其中3个复孔, 将细胞消化下来, 做成混匀的单细胞悬液, 用Cellometer Mini自动细胞计数仪计算细胞数量。

3 结果

3.1 皮肤角质形成细胞的培养与形态学观察
初期细胞悬于培养液中, 呈现透明、均质, 为个体较小的圆形。因为该种细胞较难贴壁, 在接种48h后才移动和观察细胞的贴壁情况, 48h后镜下观察到的细胞生长状况见图1和表1。由图1可见, 在 (EpiLife培养基+HKGS) 中第一代HPK在接种后d 7达到40%融合, 镜下观察可见零星杂质细胞, 圈出部分为真皮成纤维细胞 (图A2) ;在接种后d 10达到80%融合, 镜下可见杂质细胞, 圈出部分为黑素细胞 (图A3) 。在DK-SFM培养基中第一代HPK在接种后d 5达到40%融合, 镜下观察未见杂质细胞, 细胞较纯 (图B2) ;在接种后d 7达到80%融合, 镜下可见细胞较纯 (图B3) 。
图1 倒置显微镜下观察体外培养的第一代人原代角质形成细胞的生长状况 (×100) Figure 1 The growth of the first generation of human primary keratinocytes observed by inverted microscope (×100)

A: (EpiLife培养基+HKGS) 组, A1、A2、A3分别为贴壁前、接种d 7、接种d 10;B:DK-SFM培养基组, B1、B2、B3分别为贴壁前、接种d 5、接种d 7

表1 两种培养基中人原代角质形成细胞的比较Table 1 Comparisons of the first and second generations of human primary keratinocytes in two different media

3.2 第二代HPK的鉴定
免疫荧光所鉴定的HPK, 是在两种培养基中生长融合达80%后, 同比例消化传代后的第二代细胞。且鉴定的均为爬片4d后的细胞。结果显示, 细胞形态以多边形为主, 也有少量梭形等不规则形态。在紫外光的激发下, 细胞核呈蓝色, 细胞质均被染成红色, 为角蛋白阳性。用 (EpiLife培养基+HKGS) 培养, 其HPK的密度明显较DK-SFM培养基大。从细胞核的分裂状况看, (EpiLife培养基+HKGS) 中可以见到正在分裂的细胞 (图C1) , 并可见大量分裂过后的二倍体细胞, 可能说明一个细胞分裂周期刚刚过去。DK-SFM培养基中的HPK只能看见数目极少的正在分裂的细胞 (图C2) , 未见二倍体细胞。
3.3 第二代HPK在两种培养基中的细胞周期检测
图2 第二代人原代角质形成细胞免疫荧光染色结果 (×200) Figure 2 The results of the second generation of human primary keratinocytes by immunofluenscent assay (×200)

A: (EpiLife培养基+HKGS) 组;B:DK-SFM培养基组

在第二代HPK的细胞融合率达70%时, 将细胞消化, 进行传代。结果显示, 用 (EpiLife培养基+HKGS) 培养的第二代HPK的G2期以及S期细胞比例显著高于在用DK-SFM培养基培养的细胞 (图3, 表2) , 说明用 (EpiLife培养基+HKGS) 培养的第二代HPK的分裂、增殖能力更强。
图3 流式细胞仪检测第二代人原代角质形成细胞的细胞周期Figure 3 The cell cycle assay of the second generation of human primary keratinocytes by flow cytometry analysis

A: (EpiLife培养基+HKGS) 组;B:DK-SFM培养基组

表2 两种不同培养基培养的第二代人原代角质形成细胞的细胞周期分布比例Table 2 The proportion of G1, G2and S phases of the second generation of human primary keratinocytes in two different media

3.4 第一代及第二代HPK的生长曲线
从为期两周的第一代HPK在 (EpiLife培养基+HKGS) 组的生长曲线可看出, 潜伏期为4d, 指数生长期为d 5~d 10, 从d 11开始进入平台期。而在DK-SFM培养基组, 潜伏期为2d, 指数生长期为d 3~d 7, 从d 8进入平台期, 从d 12开始细胞总数开始轻微下降 (图4E1) 。提示DK-SFM培养基组第一代HPK的生长、增殖速度快于 (EpiLife培养基+HKGS) 组。然而, 从为期两周的第二代HPK (EpiLife培养基+HKGS) 组的生长曲线可看出, 潜伏期为1d, 指数生长期为d 2~d 6, 从d 7进入平台期, 从d 10开始细胞数目开始轻微减少。而DK-SFM培养基组的潜伏期长达5d, d 6~d 10为指数生长期, 并从d 11开始进入平台期 (见图4E2) 。这组数据显示, 经传代后, 第二代HPK增殖速度与第一代HPK组相比发生了明显的倒置, 即 (EpiLife培养基+HKGS) 组的速度快于DK-SFM培养基组。

4 讨论

本实验使用两步法提得HPK, 用 (EpiLife培养基+HKGS) 或DK-SFM培养基 (coating matrix kit包被+DK-SFM培养基) 将细胞配置成细胞悬液, 并以相同的密度接种于培养瓶中。在为期两周的HPK的生长中, 从生长曲线可看出, 在含BPE的 (EpiLife培养基+HKGS) 中的第一代HPK增殖速度慢于DK-SFM培养基组。在细胞纯度方面, (EpiLife培养基+HKGS) 组在细胞贴壁后便可观察到有杂细胞贴壁, 在融合后在铺路石状的HPK岛间可看到散在黑素细胞;而DK-SFM培养基中从贴壁到融合未观察到杂细胞的出现, 细胞的纯度比 (EpiLife培养基+HKGS) 组高。
在细胞培养中, 原代细胞的后续传代和培养尤为重要, 这关系到原代细胞的大量获得和保存。所以作者对第二代HPK进行了免疫荧光鉴定、细胞周期的测定以及生长曲线的绘制。结果显示, 在用同样的方法消化传代后的细胞, 以同样的细胞密度开始生长后, (EpiLife培养基+HKGS) 中的第二代HPK的生长速度显著高于DK-SFM培养基, 且 (EpiLife培养基+HKGS) 中的杂细胞减少, 纯度改善。免疫荧光在鉴定两种培养基中培养的细胞均为HPK的同时, 从照片中看出, (EpiLife培养基+HKGS) 中细胞形态比DK-SFM培养基组典型。在第二代HPK的细胞周期检测中, 发现 (EpiLife培养基+HKGS) 组中在细胞DNA合成前期的细胞比例 (G1期:67.8%) 少于DK-SFM培养基 (G1期:80.3%) , 且 (EpiLife培养基+HKGS) 组的DNA合成期以及DNA合成后期的细胞比例 (G2期:13.9%, S期:18.3%) 明显高于DK-SFM培养基组 (G2期:8.5%, S期:11.2%) , 这也从另一个角度说明了含有BPE的培养基培养的HPK传代后状态更好, 增殖能力较强。并且, 在后续多次传代过程中, 发现用 (EpiLife培养基+HKGS) 组培养的细胞传代次数比DK-SFM培养基组多, DK-SFM培养基中的细胞似乎更容易进入终末分化。
图4 在两种培养基中第一代和第二代人原代角质形成细胞的生长曲线Figure 4 The cell growth curves of the first and second generations of human primary keratinocytes in two different media

A:第一代人原代角质形成细胞;B:第二代人原代角质形成细胞;○:EpiLife培养基+HKGS;●:DK-SFM培养基

综上所述, (EpiLife培养基+HKGS) 和DK-SFM培养基 (coating matrix kit包被+DK-SFM培养基) 各有优缺点。如果想在短期获得纯度较高的HPK, 且不对原代细胞的保存以及传代有很高要求的话, DK-SFM培养基并包被1型胶原用于培养细胞较好;如果想相对长期培养HPK, 有时间纯化原代细胞, 选择EpiLife培养基并加入HKGS添加剂的培养方式更加有优势。该实验也从一种角度说明, 当下BPE对于HPK的培养以及传代依然非常重要, 还未找到一种可以完全替代BPE作用的HPK的培养方式。
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